摘要:了解三花接骨散使血清内生长激素(GH)的浓度变化与其促进骨折愈合的机理。
方法:骨折后、7、14、28日断头取血,用鼠生长激素放免试剂测定血清中GH浓度。同时取垂体称重量,石蜡包埋切片进行垂体GH免疫组化染色,测定GH细胞面积及GH细胞内激素含量。
结论:服三花接骨散14天的骨折组血清GH浓度和垂体 GH细胞内激素含量均增高。结论:服药后血清GH增高可能是三花接骨散促进骨折愈合的原因之一。

   动物实验及临床实践已证实中药三花接骨散有促进骨折愈合的作用。影响骨折愈合的因素是多方面的,本实验为探讨该中药促进骨折愈合作用机理。于1996年8月至1997年10月着重研究了骨折愈合早期阶段,三花接骨散对大鼠生长激素分泌的影响。

材料及方法
1、实验动物。Wistar成年大鼠(首都医科大学实验动物科学部提供) ,雄性共48只,体重220～260g。试验中同组同笼(每笼6只)群养,饲养室温度20～24°C,给予颗粒鼠饲料,试验中自由食水及食物,不限量。
2、药品。三花接骨散,由营口制药总厂生产(批号: 951215)。样品药液制备:用5%阿拉伯胶液制成含2%三花接骨散的均匀混悬液。
3、骨折模型制作。大鼠以5%水合氯醛(0.15ml/100g)腹膜腔内注射,麻醉成功后,左后肢小腿剃毛常规碘酒酒精消毒,选左胫骨粗隆下外侧纵切口,长约2.5cm,切开皮肤皮下,尽量勿伤皮下浅静脉,切开胫骨肌,钝分离至胫骨,沿胫骨骨膜绕周分离,内侧分开趾侧伸肌,注意勿伤隐动脉、胫前动脉和相应的神经,以小薄锯横断胫骨,横断点在胫骨粗隆下约 1cm处,缝合骨膜前骨折复位缝合皮下与皮肤,以石膏(6层纱布做膝上2cm至足趾尖石膏筒固定,7天后拆除。
4、分组和喂药。上述模型鼠随机分为:A组服药骨折组按样品0.5ml/100g体重(剂量测算见药理实验方法学第二版中“人和动物间按体表面积折算等效剂量比值表”所规定的方法),用鼠灌胃器每日喂药1次。B组单纯骨折组(对照组) ,每日用鼠灌胃器喂相应量的5%阿拉伯胶液1次。
5、取血测血清 GH浓度 上述两组试验大鼠,分别于骨折后3、7、14、28天清醒下断头取血,每只取血10ml,自然凝固,室温下低速离心(2000转/分)15分钟,取血清约2ml,贮存于-20°C备用。采用鼠GH放射免疫分析法(RIA)(试剂盒由美国 N HPP提供)测定血清GH(测试由北方生物技术研究所完成)。
6、垂体生长激素细胞免疫组化染色和测定大鼠断头后立即取出垂体,用Bouin固定液固定24h,取出用滤纸吸干固定液,用1/100000电子天平,称垂体重量。垂体常规脱水,石蜡包埋。连续切片,厚度5μm,每例取其中部最大横断面,进行生长激素细胞免疫组织化学染色,试剂由美国NHPP提供的猴抗大鼠GH抗体为Ⅰ抗,以酶标金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)代替Ⅱ抗的间接法进行染色。Ⅰ抗最佳稀释度为1∶200,金葡球蛋白A最佳稀释度为1∶40,DAB显色。设阴性对照。染色结果,用计算机灰度测试软件(灰度分32级)进行垂体前叶生长激素细胞内GH含量相对含量。同时测定生长激素细胞面积大小。每例测20个生长激素细胞,求出均数,两组间用t检验进行统计学处理。

结果
1、大鼠骨折后3天组间血清GH浓度比较,见表1。

   由表1知, A组和B组大鼠血清GH浓度B组比较A组数值高,但两组间血清GH值经统计学(t检验)统计,P>0.05,均无明显差异

2、大鼠骨折7天组间血清GH浓度比较,见表2。

   由表2知, A组和B组大鼠血清GH浓度A组较B组均数值有较明显升高,但经统计学(t检验)处理,P>0.05,两组间无明显差异

3、大鼠骨折14天组间血清GH浓度比较,见表3。

   由表3知A组和B组大鼠血清GH浓度A组较 B组有明显升高,经统计学(t检验)处理,t=2.45, P<0.05,两组间有明显差异。

4、大鼠骨折28天组间血 GH浓度比较,见表4。

由表4知, A组和B组大鼠血清GH浓度值经统计学(t检验)处理,两组间无明显差异。

5、垂体生长激素细胞免疫组化染色测定结果,见表5。

A组为服药组。B组为服阿拉伯胶组。
*表示与实验组比较P<0.001细胞内GH含量越高灰度值越低。
   由表5知,3天服药组较对照组垂体生长激素细胞GH含量低,但7、14、28天组垂体细胞GH含量均高于对照组(灰度值低)经统计学(t检验)处理,两组间均有显著差异。

讨论
1、生长激素在骨生长和骨折愈合中的作用生长激素(GH)由垂体前叶嗜酸细胞产生,以脉冲式的方式分泌,有明显的种属特异性。它是胶原生长的一种主要调节剂,在骨生长和骨折愈合中起着重要的作用。( 1)正常情况下,在肝内GH可刺激胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)生成, IGF-Ⅰ和IGFⅡ作为媒介物对成骨细胞都有很强的刺激作用。成骨细胞膜上有亲和力的Ⅰ型和Ⅱ型IGF受体, IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ可以明显促进骨细胞的有丝分裂,影响成骨细胞的分化,兴奋碱性磷酸酶活性,促进骨钙素合成并增强骨连接素的基因表达。骨折后血清GH浓度增高,同时垂体生长激素细胞(即嗜酸细胞)也处于高机能状态,上述的反应加强,促进骨折愈合。(2)GH对软骨有直接作用,可促进生长板细胞分化和生长,而骨的生长取决于生长板软骨内骨化,同时已证实GH能引起新骨生长。(3)GH可以改善肠钙吸收,兴奋肾脏1-羟化酶活性,使25(OH)D3转换为1.25(OH)2D3浓度增高,后者活性强,形成骨盐作用高于前者100倍。人类从成熟期开始,血清GH浓度开始下降,至65岁以后则大部分或全部消失,老年人GH水平的下降可以视为GHD(即GH缺乏)的一种形式,突出表现是骨密度下降。同时临床工作中也发现中老年人骨折后愈合慢、愈合晚,而血清GH浓度较高的儿童阶段,骨折后愈合快、愈合早。总之,GH对骨生长和骨折愈合有重要的影响,尽管骨折愈合的机理很复杂,有些问题尚未完全清楚,同时也绝非是GH单独起作用,但GH的作用是不容置疑的。血清GH浓度降低将不利于骨折愈合,升高将有利于或促进骨折愈合。
2、试验结果分析.由于血清GH分泌有脉冲式特点,所以检测值波动较大,同时测定每批血清样品时,标定曲线也不相同,因此分析每批血清GH浓度检测值时,本试验不做每批间横向比较,只做组内分析比较。为使每批测定值准确,我们已尽量排除了干扰因素,在取血时间、取血环境、取血方法上做到组内条件一致。从结果知,骨折后服药组与对照组血清GH浓度有一定的差异,骨折后 3天,两组无明显差异,骨折7天服药组血清 GH浓度升高但经统计学处理,二者无明显差异。至骨折14天时,服药组和对照组比较,两者有明显的差异。而在骨折后28天时,两组血清GH浓度水平又回到大体相等水平。说明三花接骨散在骨折后一定时间内有促进血清GH浓度升高的作用。另外,为了更准确地反映GH的分泌状况,本试验还对垂体生长激素细胞的体积和GH含量(用灰度值表示)进行了测定,其灰度值结果与血清GH浓度变化结果趋向是一致的。
   无论是血清GH浓度,还是垂体免疫组织化学测定结果,均表明在骨折后一定时间内,服药组远比自然骨折的变化要明显。
   三花接骨散药效学试验和临床观察结果都表明,服用三花接骨散骨折后14天时,机体在新鲜骨折的部位有骨痂生长,与对照组比较有显著差异,显示了该药促进骨折愈合的作用。与本试验结果比较,两者在时间上和结果上是一致的。所以作者认为:服用三花接骨散治疗骨折后机体内血清GH浓度的特有表现可能是该药促进骨折愈合的机理之一。

小结
   使用Wistar大鼠制作左胫骨骨折模型,分为服药组和对照组,结果表明骨折后 14天服药组与对照组GH浓度比较,有显著性差异,垂体生长激素细胞 GH含量亦有相同趋向的改变,提示三花接骨散在骨折后一定时间内有增高血清GH浓度的作用,可能是三花接骨散促进骨折愈合机理之一,试验尚需进一步加以证实,并经临床观察与总结。